Mecanismos de bioquímica · Biomolecules
Aminoácidos, péptidos y proteínas
Una lección resuelta gratis y 40 problemas de práctica en los que dibujas tú mismo cada flecha curva.
¿Atascado con aminoácidos, péptidos y proteínas? Escanea el problema.
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Lo que aprenderás
- Assign the charge state of an amino acid or peptide at a given pH from its pKa values, and calculate isoelectric points and fractions ionised.
- Draw the arrow-pushing mechanisms that make peptide bonds from activated carboxyl groups and break them in hot aqueous acid.
- Explain disulfide formation and cleavage as ionic thiol–disulfide exchange, and relate covalent and noncovalent interactions to the levels of protein structure.
- Use the chemistry of Sanger, Edman and cyanogen bromide reagents, and of trypsin specificity, to read the sequence of a peptide.
Lección gratis
El texto de la lección resuelta. En Arrow Lab, cada paso incluye sus estructuras y sus flechas dibujadas.
Leer la lección gratis (6 partes)
Un aminoácido es un conjunto de grupos ácido-base
Todo aminoácido lleva un grupo α-carboxilo (pKa alrededor de 2) y un grupo α-amonio (pKa alrededor de 9–10). Entre esos dos valores la forma dominante es el zwitterión, ⁺H₃N–CHR–COO⁻, con carga neta cero; la forma no ionizada H₂N–CHR–COOH nunca es significativa en agua. Siete cadenas laterales también se ionizan. Valores estándar de libro de texto: Asp 3.65, Glu 4.25, His 6.00, Cys 8.18, Tyr 10.07, Lys 10.53, Arg 12.48. Un grupo está mayoritariamente protonado cuando el pH es inferior a su pKa y mayoritariamente desprotonado cuando el pH es superior a él, y la ecuación de Henderson–Hasselbalch, pH = pKa + log([base]/[ácido]), da la relación exacta. El grupo α-carboxilo (pKa 2.34 en la glicina) es mucho más ácido que el ácido acético (4.76) porque el grupo amonio vecino atrae densidad electrónica y estabiliza el carboxilato por atracción electrostática.
Cómo hallar el punto isoeléctrico
El punto isoeléctrico, pI, es el pH al que la carga neta promedio es cero. Escribe las formas en orden de desprotonación, localiza la que tiene carga neta cero y promedia los dos valores de pKa que la flanquean. Glicina: (2.34 + 9.60)/2 = 5.97. Ácido aspártico: la forma neutra queda entre el α-carboxilo y el carboxilo de la cadena lateral, así que pI = (1.88 + 3.65)/2 = 2.77. Lisina: la forma neutra queda entre el α-amonio y el amonio de la cadena lateral, así que pI = (8.95 + 10.53)/2 = 9.74. Histidina: pI = (6.00 + 9.17)/2 = 7.59. Promediar los tres valores de pKa, o el α-carboxilo y el α-amonio de un aminoácido ácido o básico, es el error más común. En un péptido, cuenta todos los grupos ionizables: el amonio N-terminal, el carboxilato C-terminal y cada cadena lateral ionizable; los α-grupos internos están ocupados en enlaces peptídicos.
Formar y romper el enlace peptídico
El par solitario del nitrógeno de una amida se deslocaliza hacia el grupo carbonilo, de modo que el enlace C–N tiene carácter parcial de doble enlace. Los seis átomos Cα–C(=O)–N(H)–Cα están en un mismo plano, la rotación alrededor de C–N es lenta y casi todos los enlaces peptídicos son trans; los enlaces hacia la prolina, cuyo nitrógeno forma parte de un anillo, tienen una población cis mucho mayor. Esa misma deslocalización hace que las amidas sean los derivados de ácido carboxílico neutros menos reactivos. Mezclar una amina con un ácido carboxílico solo forma una sal de carboxilato de amonio, así que la síntesis de péptidos primero convierte el grupo carboxilo en un éster activado (un éster de N-hidroxisuccinimida) o en una O-acilisourea (con DCC), cuyo buen grupo saliente permite que la amina se adicione y que el intermediario tetraédrico se colapse. Romper un enlace peptídico sin enzima exige condiciones enérgicas, normalmente HCl 6 M a unos 110 °C durante 24 h (una base fuerte en caliente también sirve y se usa para determinar Trp): el oxígeno del carbonilo se protona, el agua se adiciona, el nitrógeno se protona y sale como amina neutra, que el ácido convierte de inmediato en ion amonio. Esas condiciones ácidas transforman Asn y Gln en Asp y Glu y destruyen la mayor parte del Trp.
Disulfuros y los niveles de estructura de las proteínas
El tiol de la cisteína (pKa 8.18) es un nucleófilo moderado, pero su tiolato es excelente. El intercambio tiol–disulfuro es una reacción SN2 sobre el azufre: un tiolato ataca a uno de los azufres de un disulfuro y el otro azufre sale como tiolato. Como solo reacciona el tiolato, el intercambio se acelera a medida que el pH sube hacia el pKa del tiol. El ditiotreitol (DTT) reduce los disulfuros por completo porque su segundo tiol cierra un disulfuro cíclico de seis miembros, un paso intramolecular que favorece fuertemente los productos. El reactivo de Ellman (DTNB) usa ese mismo intercambio para liberar un tiolato amarillo, TNB²⁻ (ε alrededor de 14,150 M⁻¹ cm⁻¹ a 412 nm), uno por cada tiol. La formación de un disulfuro es una oxidación: cada azufre pasa de −2 en el tiol a −1 en el disulfuro. Las proteínas se describen en cuatro niveles: la estructura primaria es la secuencia covalente; la secundaria es el patrón local de puentes de hidrógeno del esqueleto, como la α-hélice (C=O del residuo i al N–H del residuo i + 4) y la lámina β; la terciaria es el plegamiento tridimensional completo de una cadena, impulsado en gran medida por el enterramiento de las cadenas laterales hidrófobas; la cuaternaria es el ensamblaje de varias cadenas.
Leer una secuencia con química
El reactivo de Sanger, el 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno, marca los grupos amino libres por sustitución nucleofílica aromática; tras una hidrólisis ácida total, el aminoácido DNP amarillo identifica el residuo N-terminal, y el grupo amino de la cadena lateral de cada lisina también reacciona. La degradación de Edman es más suave y repetitiva. El fenilisotiocianato se adiciona a la amina N-terminal a unos pH 9 para dar un péptido feniltiocarbamoilo; el ácido trifluoroacético anhidro permite entonces que el azufre de la tiourea ataque el primer carbonilo peptídico, liberando una anilinotiazolinona (dibujada aquí para la glicina) y el péptido intacto con un residuo menos. La anilinotiazolinona se convierte en la feniltiohidantoína estable para su identificación. Cada ciclo es un poco menos del 100 % eficiente, así que la fracción de cadenas que sigue en fase tras n ciclos es (eficiencia)ⁿ, lo que limita una corrida a unas pocas docenas de residuos. Las cadenas más largas se cortan primero: la tripsina corta después de Lys y Arg (no antes de Pro), y el bromuro de cianógeno corta después de Met, convirtiéndola en una homoserina lactona C-terminal. Los fragmentos solapados de dos cortes distintos fijan luego el orden.
Lo que conviene recordar
Trata todo aminoácido y todo péptido como una colección de grupos ácido-base con valores de pKa conocidos, y promedia los pKa que flanquean la forma neutra para obtener el pI. Los enlaces peptídicos solo se forman a partir de grupos carboxilo activados y solo se rompen en condiciones enérgicas, como HCl 6 M en caliente. Los tiolatos intercambian con los disulfuros por SN2 sobre el azufre. Los reactivos de secuenciación no son más que sustituciones nucleofílicas dirigidas a la amina N-terminal, al azufre o al primer carbonilo peptídico.
Problemas de práctica (40)
Practicar es gratis con una cuenta.
Dibuja el mecanismo 10
Enlaces peptídicos: formación y ruptura
- Acoplamiento con DCC de N-acetilglicina y éster metílico de alaninaDibuja cómo el DCC activa el grupo carboxilo de la N-acetilglicina como O-acilisourea y cómo el éster metílico de alanina forma después el enlace peptídico, liberando N,N′-diciclohexilurea.
- Hidrólisis ácida de la glicilglicinaDibuja la hidrólisis catalizada por ácido del enlace peptídico de la glicilglicina, usando H₃O⁺ y agua como único ácido y única base, para dar dos cationes de glicina.
- Formación de un enlace peptídico a partir de un éster de N-hidroxisuccinimidaDibuja la adición de la amina del éster metílico de alanina al éster NHS activado de la N-acetilglicina, el colapso del intermediario tetraédrico con pérdida del anión N-oxisuccinimida y la transferencia de protón final que da el enlace peptídico neutro.
Disulfuros y estructura de proteínas
- El ditiotreitol reduce la cistinaDibuja los dos intercambios tiol–disulfuro mediante los cuales el ditiotreitol reduce la cistina a dos cisteínas, terminando con el cierre intramolecular del anillo hacia el disulfuro cíclico del DTT.
- El reactivo de Ellman detecta el tiol de una cisteínaDibuja el intercambio tiol–disulfuro entre el tiolato de cisteína y el DTNB que libera el anión TNB²⁻ amarillo, y la resonancia que deslocaliza su carga hacia el grupo nitro para.
- El tiolato de glutatión intercambia con la cistinaDibuja el ataque SN2 del tiolato de glutatión sobre un azufre de la cistina que libera tiolato de cisteína y forma el disulfuro mixto glutatión–cisteína.
Química de secuenciación
- Acoplamiento de Edman: fenil isotiocianato y Gly-AlaDibuja la adición de la amina N-terminal de Gly-Ala al fenil isotiocianato y las transferencias de protón que dan el péptido feniltiocarbamoilo.
- Escisión de Edman: el azufre de la tiourea corta el primer residuoDibuja la ciclación en ácido anhidro del feniltiocarbamoil-Gly-Ala en la que el azufre de la tiourea ataca el primer carbonilo peptídico y libera alanina más la anilinotiazolinona de la glicina.
- El reactivo de Sanger marca el extremo N de la Gly-AlaDibuja la sustitución nucleofílica aromática en la que la amina del extremo N de la Gly-Ala desplaza al fluoruro del 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno a través de un complejo de Meisenheimer, dando el DNP-péptido.
Carga, pKa y pI
- Valoración de la histidina con hidróxidoDibuja las dos transferencias de protón que convierten la forma +1 de la histidina en su forma −1, quitando primero el protón del imidazolio y después el del α-amonio.
Predice el producto 6
Enlaces peptídicos: formación y ruptura
- ¿Qué sobrevive a la hidrólisis ácida total?Predice cómo cambian las amidas de cadena lateral y los residuos sensibles al ácido durante la hidrólisis ácida total de una proteína.
Carga, pKa y pI
- Alanina en un tampón de pH 7Predice el estado de protonación dominante de un aminoácido sencillo a pH fisiológico a partir de sus dos valores de pKa.
- El glutamato a pH fisiológicoPredice la forma dominante y la carga neta de un aminoácido ácido a pH 7.4.
Disulfuros y estructura de proteínas
- ¿Qué residuo se esconde en el núcleo?Predice la ubicación de un residuo en una proteína globular plegada a partir de la polaridad de su cadena lateral.
Química de secuenciación
- ¿Qué deja atrás el bromuro de cianógeno?Predice el fragmento que se forma cuando el bromuro de cianógeno corta un péptido en la metionina.
- Análisis de Sanger de Lys-GlyPredecir el aminoácido DNP que se obtiene cuando el residuo N-terminal de un péptido es lisina.
Clasificar 3
Enlaces peptídicos: formación y ruptura
- ¿Cuál estructura es Ala-Gly?Identifica un dipéptido a partir de su nombre usando la convención de N-terminal a C-terminal.
- La forma de resonancia detrás de la rigidez del enlace peptídicoDistingue el contribuyente de resonancia con separación de cargas de una amida de sus tautómeros.
Disulfuros y estructura de proteínas
- ¿Qué nivel estructural es una hélice α?Clasifica un patrón de enlaces de hidrógeno del esqueleto como un nivel de estructura proteica.
Comparar 3
Enlaces peptídicos: formación y ruptura
- ¿Qué dador de acilo forma un enlace peptídico más rápido?Ordena derivados de acilo según su reactividad frente a una amina usando la basicidad de sus grupos salientes.
- ¿Dónde se encuentran enlaces peptídicos cis?Comparar las preferencias cis/trans de los enlaces peptídicos e identificar el enlace X–Pro como el que presenta una población cis significativa.
Carga, pKa y pI
- Ordenar aminoácidos por punto isoeléctricoOrdenar aminoácidos ácidos, neutros y básicos por punto isoeléctrico tras calcular cada pI a partir de sus valores de pKa.
Calcular 12
Carga, pKa y pI
- Punto isoeléctrico del ácido aspárticoCalcula el punto isoeléctrico de un aminoácido ácido identificando los dos valores de pKa que flanquean su forma de carga neta cero.
- Punto isoeléctrico de la glicinaCalcula el punto isoeléctrico de un aminoácido sin cadena lateral ionizable a partir de sus dos valores de pKa.
- ¿Cuánta histidina está protonada a pH 7?Usa la ecuación de Henderson–Hasselbalch para calcular el porcentaje de cadenas laterales de histidina que están protonadas a un pH dado.
- Punto isoeléctrico de la histidinaCalcular el punto isoeléctrico de la histidina, cuyo pKa de cadena lateral queda entre los dos valores de pKa de los grupos α.
- Punto isoeléctrico de la lisinaCalcular el punto isoeléctrico de un aminoácido básico a partir de los valores de pKa de sus dos grupos amonio.
- Carga neta de Asp-Lys-Glu-Ala a pH 7Calcula la carga neta de un péptido a un pH dado contando solo sus extremos y las cadenas laterales ionizables.
Disulfuros y estructura de proteínas
- ¿Cuánta cisteína está como tiolato a pH 7,4?Calcula el porcentaje de un tiol de cisteína presente como el tiolato reactivo a pH fisiológico.
- Estado de oxidación del azufre en la cistinaAsigna el estado de oxidación del azufre en un disulfuro y reconoce la formación del disulfuro como una oxidación.
- Contar tioles con el reactivo de EllmanCalcula la concentración de tiol a partir de la absorbancia del TNB²⁻ liberado en un ensayo de Ellman.
Química de secuenciación
- ¿Hasta dónde puede leer la degradación de Edman?Calcula el rendimiento acumulado de las cadenas que van en fase después de muchos ciclos de Edman a partir de la eficiencia por ciclo.
- Cuenta los fragmentos trípticosAplica la regla de corte de la tripsina, incluida la excepción de la prolina, para contar los fragmentos de un péptido.
Enlaces peptídicos: formación y ruptura
- Masa molar de Gly-Ala-SerCalcula la masa molar de un péptido a partir de las masas de los aminoácidos libres restando una molécula de agua por cada enlace peptídico.
Encuentra el error 1
- La degradación de Edman no da nadaDiagnostica por qué la degradación de Edman de un péptido intacto y puro no produce ningún derivado PTH en ningún ciclo.
Interpreta la evidencia 1
- Interpretar la curva de titulación de la glicinaInterpreta un punto de la curva de titulación de la glicina como el punto de semiequivalencia de su grupo carboxilo.
Trabaja hacia atrás 1
- Armar la secuencia a partir de dos digestionesReconstruir la secuencia completa de un octapéptido a partir de fragmentos solapados de tripsina y bromuro de cianógeno.
Planea una síntesis 1
- Mantener separadas dos cadenas para secuenciarlasPlanificar el orden de reactivos que rompe los disulfuros de una proteína e impide que se vuelvan a formar antes de la secuenciación.
Explica por qué 2
Carga, pKa y pI
- ¿Por qué es tan ácido el α-carboxilo?Explica por qué el grupo α-carboxilo de un aminoácido es más ácido que el ácido acético.
Enlaces peptídicos: formación y ruptura
- ¿Por qué es plano el grupo peptídico?Explicar la planaridad y la rotación restringida del enlace peptídico en términos de la resonancia amida.
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