Mecanismos de bioquímica · Enzymes
Catálisis enzimática y cinética
Una lección resuelta gratis y 40 problemas de práctica en los que dibujas tú mismo cada flecha curva.
¿Atascado con catálisis enzimática y cinética? Escanea el problema.
Toma una foto de la reacción de tu tarea o de tu libro y dibuja su mecanismo con cada flecha revisada. 1 escaneo gratis ya, sin registrarte; 1 más con una cuenta gratuita.
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Lo que aprenderás
- Explain how general acid–base, covalent and metal-ion catalysis lower the activation barrier without changing the equilibrium constant.
- Draw the arrow-pushing mechanisms of serine, cysteine and aspartic proteases, lysozyme, ribonuclease A and carbonic anhydrase with the correct proton donors and acceptors.
- Calculate rates, kcat, kcat/Km and apparent Km values from the Michaelis–Menten equation and inhibition data.
- Classify reversible inhibitors as competitive, uncompetitive or noncompetitive from kinetic data and distinguish them from irreversible inactivators.
Lección gratis
El texto de la lección resuelta. En Arrow Lab, cada paso incluye sus estructuras y sus flechas dibujadas.
Leer la lección gratis (9 partes)
Las enzimas bajan la barrera, no el equilibrio
Una enzima se une al estado de transición con más fuerza que al sustrato, de modo que ΔG‡ disminuye mientras que ΔG° y la constante de equilibrio permanecen iguales; las reacciones directa e inversa se aceleran en el mismo factor. A 25 °C, cada 5.7 kJ/mol de ΔG‡ que se eliminan (2.303RT) hacen que la reacción sea diez veces más rápida. Las moléculas estables que copian la geometría del estado de transición son análogos del estado de transición y se unen con mucha fuerza. Las proteasas aspárticas adicionan agua al C=O de un péptido a través de un gem-diol tetraédrico; sustituir el C(=O)–NH que se rompe por CH(OH)–CH₂ conserva un carbono carbinólico tetraédrico en esa posición, pero no deja ningún enlace que cortar. Un carbono carbinólico en lugar del carbono del gem-diol es el diseño que hay detrás de la pepstatina (su unidad de estatina) y de muchos inhibidores de la proteasa del HIV-1 (dibujados: el gem-diol a partir de N-metilacetamida y su mimético CH(OH)–CH₂). La unión también mantiene los grupos que reaccionan muy cerca y bien alineados. La molaridad efectiva de un grupo vecino, k_intra/k_inter, puede ser de cientos de mol/L, mucho mayor que cualquier concentración alcanzable.
Catálisis ácido general y base general
Una base general sustrae un protón en el mismo paso en que un nucleófilo ataca; un ácido general cede un protón a un grupo saliente mientras este se va. La histidina es la opción más común porque su cadena lateral de imidazol tiene un pKa cercano a 6–7, de modo que a pH 7 están presentes tanto el imidazol neutro (base) como el ion imidazolio (ácido). Los carboxilatos de Asp y Glu (pKa alrededor de 4) suelen actuar como bases, o como ácidos cuando un bolsillo no polar eleva su pKa. Un perfil de pH–velocidad muestra qué estados se necesitan: una rama que sube con el pH indica un grupo que debe estar desprotonado, una rama que baja indica un grupo que debe permanecer protonado, y una forma de campana significa que se requieren ambos.
Catálisis covalente: proteasas de serina y de cisteína
En la quimotripsina, la tríada Asp102–His57–Ser195 convierte a Ser195 en un nucleófilo fuerte: His57 toma el protón del hidroxilo mientras el oxígeno ataca al carbonilo del péptido. El oxianión tetraédrico queda retenido por dos grupos N–H del esqueleto, el agujero de oxianión. His57, ahora protonada, cede su protón al nitrógeno saliente, de modo que lo que se va es una amina neutra y no Ser195, y se forma un éster acil-enzima. Después el agua ataca al éster con His57 como base, y la enzima se regenera. Los donadores de acilo con mejores grupos salientes reaccionan más rápido (amida < éster de alquilo < éster de arilo < anhídrido): con acetato de p-nitrofenilo, la acilación es rápida y la desacilación lenta, así que aparece un p-nitrofenolato amarillo por sitio activo en una ráfaga antes del estado estacionario lento, y el tamaño de la ráfaga cuenta los sitios activos. Las proteasas de cisteína, como la papaína, usan un par iónico tiolato de Cys25–ion imidazolio de His159 y forman un tioéster acil-enzima en lugar del éster. El bolsillo S1 determina la especificidad: la quimotripsina corta después de Phe, Tyr y Trp, la tripsina después de Lys y Arg (Asp189 en el fondo del bolsillo), y la elastasa después de residuos pequeños.
Dos grupos carboxilo: proteasas aspárticas y lisozima
Las proteasas aspárticas (pepsina, proteasa del HIV-1) no forman intermediario covalente. Un aspartato desprotona una molécula de agua mientras esta ataca al carbonilo, y el otro ácido aspártico protona al oxígeno del carbonilo, lo que da un gem-diol neutro; luego los papeles se intercambian para expulsar la amina. La lisozima corta un enlace β-glucosídico con Glu35 (protonado, en un bolsillo no polar) como ácido general y Asp52 (ionizado) como nucleófilo que forma un glucósido-enzima covalente. Después el agua, desprotonada por Glu35, desplaza a Asp52. Las dos inversiones dan como resultado una retención global de la configuración β.
Ribonucleasa A y anhidrasa carbónica
La ribonucleasa A usa dos histidinas. His12, como base, desprotona el 2′-OH, que ataca al fósforo; His119, como ácido, protona el 5′-oxígeno del nucleótido saliente. El producto es un 2′,3′-fosfato cíclico, un anillo de cinco miembros, que esas mismas dos histidinas hidrolizan después con los papeles invertidos. El DNA no tiene 2′-OH y no se corta. La anhidrasa carbónica une Zn²⁺ a tres histidinas y una molécula de agua. El metal baja el pKa del agua unida hasta alrededor de 7, de modo que un hidróxido unido al zinc ataca al CO₂ a pH neutro; el agua desplaza al bicarbonato y His64 transporta un protón para regenerar el Zn–OH.
Cinética de Michaelis–Menten
Para E + S ⇌ ES → E + P, la velocidad inicial es v = Vmax[S]/(Km + [S]). Km es la concentración de sustrato que da la mitad de Vmax; es igual a (k−1 + k2)/k1, por lo que coincide con la constante de disociación k−1/k1 solo cuando k2 es mucho menor que k−1. kcat = Vmax/[E]T es el número de recambio, y kcat/Km, la constante de especificidad, compara sustratos que compiten por la misma enzima; su límite superior es la difusión, alrededor de 10⁸–10⁹ M⁻¹ s⁻¹.
Inhibición
Un inhibidor competitivo se une a la enzima libre en el sitio activo: Vmax no cambia y el Km aparente sube a Km(1 + [I]/Ki), de modo que un sustrato en exceso lo revierte. Un inhibidor acompetitivo se une solo a ES y disminuye Vmax y Km en el mismo factor, lo que da rectas paralelas en el gráfico de Lineweaver–Burk. Un inhibidor no competitivo puro se une por igual a E y a ES, y disminuye Vmax sin cambiar Km; los inhibidores mixtos alteran ambos. Los inactivadores irreversibles, como el reactivo de laboratorio PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonilo) sobre la serina del sitio activo, eliminan enzima activa de forma covalente y no se describen mediante Ki. Las moléculas que dejan sin modificar son normales, así que la inactivación irreversible también disminuye Vmax sin cambiar Km. Comprueba la reversibilidad directamente: la inhibición reversible suele actuar de inmediato y desaparece con una gran dilución o diálisis, mientras que la inactivación irreversible aumenta con el tiempo de preincubación y sobrevive a ambas. Los reactivos específicos de clase también identifican una proteasa: PMSF para serina, iodoacetamida para cisteína, pepstatina para aspárticas y quelantes de metales como el EDTA para metaloproteasas.
Cómo los dibujos modelan un sitio activo
Los mecanismos dibujan solo la parte reactiva de cada residuo: metanol para la cadena lateral de Ser, metanotiolato para Cys, imidazol para His, acetato o ácido acético para Asp y Glu, y un ion zinc desnudo para el centro Zn(His)₃. Sustratos cortos como la N-metilacetamida representan a un péptido. El flujo de electrones es el mismo que en la enzima; la unión, el agujero de oxianión y la proteína que rodea se describen con palabras.
Lo que conviene recordar
Las enzimas aceleran las reacciones al unirse al estado de transición y al colocar ácidos, bases, nucleófilos e iones metálicos exactamente donde los electrones los necesitan. Sigue cada protón: el residuo que sustrae un protón en un paso normalmente lo devuelve en el siguiente, así que el catalizador termina sin cambios. La cinética mide entonces qué tan bien funciona esto: kcat para el recambio, Km para la concentración de sustrato a media saturación, kcat/Km para la especificidad, y el cambio en Vmax o Km para el tipo de inhibición.
Problemas de práctica (40)
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Dibuja el mecanismo 15
Proteasas de serina y de cisteína
- La acetilcolinesterasa acetila su serina del sitio activoDibuja cómo la serina catalítica de la acetilcolinesterasa se acetila por la acetilcolina, con la histidina como base general y luego como ácido general para que salga colina neutra.
- Quimotripsina y acetato de p-nitrofenilo: el estallidoDibuja la acilación rápida de la Ser195 por el acetato de p-nitrofenilo y la resonancia que hace del p-nitrofenolato liberado un buen grupo saliente y un cromóforo amarillo.
- Acilación de la papaína: un tiolato forma una acil-enzima tipo tioésterDibuja cómo el tiolato de la Cys25 de una cisteína proteasa ataca un carbonilo peptídico y cómo la His159 protona la amina saliente para formar la acil-enzima tipo tioéster.
- La desacilación de la papaína regenera el par tiolato–imidazolioDibuja cómo el agua, activada por His159, hidroliza el acil-enzima tioéster de una proteasa de cisteína y restaura el tiolato de Cys25.
- La iodoacetamida alquila la cisteína del sitio activoDibuja la alquilación SN2 del tiolato de la cisteína del sitio activo de la papaína por la iodoacetamida.
- Acilación de la quimotripsina: la tríada catalítica forma el acil-enzimaDibuja cómo His57 activa a Ser195 para atacar el carbonilo del péptido, cómo colapsa el oxianión tetraédrico y cómo His57 protona la amina saliente para dar el acil-enzima.
- Desacilación de la quimotripsina: el agua hidroliza la acil-enzimaDibuja cómo His57 activa el agua para que ataque el éster de la acil-enzima y luego protona Ser195 a medida que este se va, regenerando la enzima libre.
- Acilación por tripsina: His57 convierte la amina en grupo salienteDibuja cómo Ser195 de la tripsina se adiciona a una amida de lisina y cómo His57, actuando ahora como ácido general, hace que el intermediario tetraédrico expulse la amina en lugar de Ser195.
Catálisis ácido-base y por iones metálicos
- Aspartato proteasa: el gem-diol se descomponeDibuja cómo los dos aspartatos intercambian sus papeles para descomponer el intermediario gem-diol en un ácido carboxílico y una amina, restaurando la enzima de partida.
- Aspartato proteasa: dos aspartatos adicionan agua al enlace peptídicoDibuja cómo una base general aspartato y un ácido general aspártico actúan juntos para adicionar agua a un carbonilo peptídico, formando el intermediario gem-diol neutro.
- Anhidrasa carbónica: el hidróxido de zinc hidrata el CO₂Dibuja cómo el hidróxido unido al zinc se adiciona al CO₂, cómo el agua desplaza el bicarbonato del zinc y cómo la His64 regenera el hidróxido de zinc.
- Lisozima: Asp52 forma la glucosil-enzimaDibuja cómo Glu35 protona el oxígeno del azúcar saliente mientras Asp52 lo desplaza en el carbono anomérico para formar la glucosil-enzima covalente.
- Lisozima: el agua libera el azúcar con retenciónDibuja cómo Glu35 activa el agua para que ataque el carbono anomérico de la glucosil-enzima, liberando el hemiacetal del azúcar y regenerando Asp52.
- Ribonucleasa A: hidrólisis del fosfato cíclico 2′,3′Dibuja cómo His119 y His12 intercambian sus papeles para hidrolizar el fosfato cíclico 2′,3′ a 3′-fosfato, regenerando la enzima.
- Ribonucleasa A: el 2′-OH forma un fosfato cíclico 2′,3′Dibuja cómo His12 y His119 actúan como base general y ácido general mientras el 2′-OH del ARN ataca el fósforo para dar un fosfato cíclico 2′,3′.
Predice el producto 3
Cinemática de Michaelis–Menten e inhibición
- Elige un inhibidor competitivoPredice cuál de los compuestos parecidos al sustrato actúa como inhibidor competitivo de la succinato deshidrogenasa.
Catálisis ácido-base y por iones metálicos
- ¿Qué anómero libera una glucosidasa retenedora?Predice la configuración anomérica del primer producto que se forma en una glucosidasa retenedora de doble desplazamiento.
Proteasas de serina y de cisteína
- ¿Dónde corta la tripsina?Predice el residuo P1 que prefiere la tripsina a partir de la carga de su bolsillo S1.
Clasificar 5
Cinemática de Michaelis–Menten e inhibición
- Clasifica un inhibidor a partir de Vmax y KmClasifica un inhibidor reversible como competitivo a partir de un Vmax que no cambia y un Km aparente que aumenta.
Estrategias catalíticas
- ¿Qué enzima usa catálisis covalente?Identifica la enzima que forma un intermediario covalente enzima–sustrato.
- Nombra el papel de His57Clasifica el papel de His57 en el ataque de Ser195 como catálisis básica general.
- ¿Qué cadena lateral puede ser ácido o base?Elige el modelo de cadena lateral cuyo pKa le permite actuar como ácido general o como base general cerca de pH 7.
Catálisis ácido-base y por iones metálicos
- Clasifica una proteasa a partir de sus inhibidoresAsigna una proteasa a su clase catalítica a partir de su respuesta a inhibidores específicos de cada clase.
Comparar 2
Proteasas de serina y de cisteína
- Ordena los donadores de acilo frente a Ser195Ordena cuatro donadores de acetilo según la facilidad con que acilan una serina del sitio activo, usando los valores de pKa del grupo saliente.
Cinemática de Michaelis–Menten e inhibición
- Ordena los sustratos según la constante de especificidadOrdena los sustratos en competencia según kcat/Km, y no solo según kcat o Km.
Calcular 8
Proteasas de serina y de cisteína
- Cuenta los sitios activos a partir de la ráfagaCalcula la concentración de enzima activa a partir de la amplitud de una ráfaga en estado preestacionario.
Cinemática de Michaelis–Menten e inhibición
- Km aparente con un inhibidor competitivoCalcula el Km aparente en presencia de un inhibidor competitivo a partir de Ki y de la concentración del inhibidor.
- Km no siempre es la constante de disociaciónCalcula Km a partir de las constantes de velocidad individuales del esquema de Michaelis–Menten y compárala con Kd.
- Velocidad inicial a partir de la ecuación de Michaelis–MentenCalcula una velocidad inicial a partir de Vmax, Km y la concentración de sustrato.
- Número de recambio a partir de VmaxCalcula kcat a partir de Vmax y de la concentración total de enzima, con unidades coherentes.
Estrategias catalíticas
- Molaridad efectiva de un grupo vecinoCalcula una molaridad efectiva a partir de constantes de velocidad intramolecular e intermolecular y relaciónala con la proximidad y la orientación.
- Reducción de la barrera para un aumento de velocidad de 10⁶ vecesCalcula cuánto debe bajar ΔG‡ una enzima para producir un aumento de velocidad determinado.
Catálisis ácido-base y por iones metálicos
- ¿Cuánto hidróxido de zinc a pH 7.5?Calcula la fracción de anhidrasa carbónica en la forma activa de hidróxido de zinc a partir del pKa del agua unida al zinc.
Encuentra el error 1
- ¿Reversible o irreversible?Diagnostica un inhibidor mal clasificado a partir de su dependencia del tiempo y de que no se elimina al diluir ni al dializar.
Interpreta la evidencia 3
Estrategias catalíticas
- Interpreta un perfil de pH–velocidadAsigna la rama ácida del perfil de pH–velocidad de la quimotripsina al residuo que debe estar desprotonado.
Catálisis ácido-base y por iones metálicos
- ¿Por qué la actividad de la RNasa A tiene forma de campana?Explica un perfil de pH–velocidad en forma de campana a partir de los estados de protonación opuestos que necesitan dos histidinas catalíticas.
Cinemática de Michaelis–Menten e inhibición
- Rectas paralelas en el doble recíprocoIdentifica la inhibición acompetitiva a partir de rectas paralelas de Lineweaver–Burk.
Trabaja hacia atrás 1
- ¿Qué sustrato formó este acil-enzima?Trabaja hacia atrás desde un acil-enzima hasta el sustrato peptídico y el enlace que cortó la quimotripsina.
Planea una síntesis 1
- Diseña un análogo del estado de transiciónElige el isóstero estable que mejor imita el intermediario tetraédrico gem-diol de la hidrólisis de amidas por las aspartil proteasas.
Explica por qué 1
- ¿Qué cambia una enzima?Explica por qué una enzima acelera una reacción sin cambiar su constante de equilibrio.
¿Atascado con catálisis enzimática y cinética? Escanea el problema.
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