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Química biológica · Peptides and nucleic acids

Química y síntesis de ácidos nucleicos

Una lección resuelta gratis y 40 problemas de práctica en los que dibujas tú mismo cada flecha curva.

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Lo que aprenderás

  • Name nucleosides and nucleotides, number their sugar atoms, and recognise the β-N-glycosidic bond, the sugar pucker and the 3′→5′ phosphodiester link with its charge.
  • Explain Watson–Crick pairing, the major tautomers of the bases and their pKa values, and calculate charges, hydrogen-bond counts and protonation fractions.
  • Quantify oligonucleotides by UV absorbance at 260 nm with the Beer–Lambert law, and relate hyperchromicity and melting temperature to base stacking and G·C content.
  • Draw the phosphoramidite cycle: DMT removal, tetrazole activation, coupling, capping and iodine oxidation of P(III) to P(V), and calculate yields from coupling efficiency and the trityl assay.
  • Choose protecting groups for the bases, phosphates and RNA 2′-OH, draw their removal, and explain from the 2′-OH transesterification why RNA is far less stable than DNA in base.

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Nucleósidos, nucleótidos y su numeración

Un nucleósido es una base unida a un azúcar mediante un enlace β-N-glucosídico desde el C1′ del azúcar hasta el N9 de una purina (adenina, guanina) o el N1 de una pirimidina (citosina, timina, uracilo). Los átomos del azúcar llevan primas (C1′ a C5′) para no confundirlos con los átomos del anillo de la base. β significa que la base se encuentra en la misma cara del anillo de furanosa que el grupo C4′–CH₂OH; el α-anómero, con la base en la cara opuesta, no se encuentra en los ácidos nucleicos naturales. El ARN usa ribosa (adenosina, guanosina, citidina, uridina); el ADN usa 2′-desoxirribosa (2′-desoxiadenosina, 2′-desoxiguanosina, 2′-desoxicitidina y timidina). El anillo de furanosa no es plano: se pliega de modo que el C2′ o el C3′ queda fuera del plano, del mismo lado que el C5′ (C2′-endo o C3′-endo). El ADN de forma B prefiere C2′-endo; los dúplex de ARN son de forma A y prefieren C3′-endo, porque el 2′-OH favorece ese plegamiento. Un nucleótido es un éster fosfato de un nucleósido, normalmente en el 5′-OH. En una cadena, cada fosfodiéster une el 3′-O de un nucleótido con el 5′-O del siguiente, y las secuencias se escriben 5′→3′. El dibujo es el dinucleótido d(ApT): 2′-desoxiadenosina a la izquierda, cuyo 3′-O se une a través de un fosfodiéster al 5′-O de la timidina. El P–OH de un fosfodiéster tiene pKa ≈ 1, así que cada fosfato interno lleva una carga negativa a pH 7, y un n-mero lineal con extremos 5′-OH y 3′-OH libres lleva n − 1 cargas.

Apareamiento de bases, tautómeros e ionización

En los pares de Watson–Crick, la guanina se aparea con la citosina mediante tres enlaces de hidrógeno (O6 con H–N4, N1–H con N3, N2–H con O2) y la adenina con la timina o el uracilo mediante dos (N6–H con O4, N1 con H–N3). Por eso el ADN de doble cadena tiene %A = %T y %G = %C. El apareamiento depende de los tautómeros principales, las formas ceto (lactama) y amino. Un tautómero enol raro de la guanina o un tautómero imino de la adenina presenta un patrón incorrecto de donadores y aceptores y se aparea con T o C en lugar de con su pareja normal. Las bases son prácticamente neutras a pH 7. Los ácidos conjugados tienen pKa ≈ 4,2 (N3 de la citidina), ≈ 3,5 (N1 de la adenosina) y ≈ 2 (N7 de la guanosina), y los ácidos N–H tienen pKa ≈ 9,2 (N1–H de la guanosina), 9,3 (N3–H de la uridina) y 9,8 (N3–H de la timidina). Solo los fosfatos están cargados, y el 2′-OH de la ribosa (pKa ≈ 12,5) se ioniza únicamente en medio fuertemente básico. El dibujo muestra 9-metilguanina y 1-metilcitosina, el par de bases con los azúcares sustituidos por grupos metilo.

Medición de ácidos nucleicos por UV

Las bases aromáticas absorben intensamente cerca de 260 nm, así que los ácidos nucleicos se cuantifican con la ley de Beer–Lambert, A = εcl. Para un oligonucleótido, ε₂₆₀ es aproximadamente la suma de los valores de sus nucleótidos (del orden de 10⁴ M⁻¹ cm⁻¹ por base), de modo que un 20-mero tiene ε₂₆₀ cercano a 2 × 10⁵ M⁻¹ cm⁻¹. Una muestra diluida debe multiplicarse por el factor de dilución. Las bases apiladas en un dúplex absorben menos que las mismas bases no apiladas. Cuando un dúplex se desnaturaliza y pasa a cadenas sencillas, la A₂₆₀ aumenta (hipercromicidad, típicamente 10–40 %), y el porcentaje es (A_desnaturalizada − A_dúplex)/A_dúplex × 100. La temperatura de fusión, Tm, es la temperatura a la que se ha fundido la mitad del dúplex, el punto medio del aumento. La Tm aumenta con el contenido de G·C (tres enlaces de hidrógeno y mayor apilamiento), con la longitud y con la concentración de sal, porque los cationes apantallan la repulsión entre las dos cadenas con carga negativa.

El ciclo del fosforamidito

Los oligonucleótidos se sintetizan desde el extremo 3′ hacia el extremo 5′ sobre un soporte sólido, con el primer nucleósido unido a través de un éster 3′-O-succinilo. Cada bloque de construcción es un 5′-O-DMT nucleósido 3′-O-(2-cianoetil N,N-diisopropilfosforamidito), dibujado aquí para la timidina; se prepara a partir del 3′-OH del nucleósido y del 2-cianoetil N,N-diisopropilclorofosforamidito con una base amínica impedida. Un ciclo tiene cuatro pasos. Destritilación: el ácido dicloroacético al 3 % (pKa ≈ 1,3) o el ácido tricloroacético (pKa ≈ 0,7) en CH₂Cl₂ libera el catión DMT anaranjado (λmax ≈ 498 nm). Acoplamiento: un activador como el 1H-tetrazol (pKa ≈ 4,9) o el 5-(etiltio)-1H-tetrazol más ácido (ETT, pKa ≈ 4,3) protona el nitrógeno diisopropilamino, y el azólido desplaza a la amina. El 5′-OH libre ataca entonces el fosfito de tetrazolilo para dar un fosfito triéster. El disolvente debe estar seco, porque el agua convierte el amidito activado en un H-fosfonato poco reactivo. Tapado: el anhídrido acético con N-metilimidazol forma un ion N-acetilimidazolio que acetila cualquier 5′-OH que no haya reaccionado, de modo que esa cadena no puede crecer y dar un producto de deleción al que le falta un nucleótido (n − 1). Oxidación: el I₂ en agua/piridina convierte el fosfito triéster P(III), lábil en medio ácido, en un fosfotriéster P(V) estable antes del siguiente paso ácido. Si cada acoplamiento tiene un rendimiento y, la fracción de longitud completa de un n-mero es y^(n − 1). El ensayo del tritilo mide y: las cadenas tapadas ya no liberan DMT, así que la absorbancia del DMT cae en un factor y por ciclo, y y = (A_tardía/A_temprana)^(1/k) para k acoplamientos entre las dos lecturas.

Grupos protectores y desprotección final

Todo nucleófilo excepto el 5′-OH debe estar enmascarado durante el acoplamiento. Los grupos amino exocíclicos de A, C y G se protegen como amidas (N6-benzoil-dA, dibujado aquí, N4-benzoil- o N4-acetil-dC y N2-isobutiril-dG); la timina y el uracilo no tienen grupo amino y no necesitan protección. Las amidas resisten el ácido, el activador y el yodo de cada ciclo, pero se eliminan al final. El amoniaco acuoso concentrado a unos 55 °C hace todo el trabajo final de una vez: rompe el éster succinilo que une la cadena al soporte, elimina cada grupo 2-cianoetilo del fósforo por β-eliminación (liberando acrilonitrilo y el anión fosfodiéster) y elimina las amidas por aminólisis. El éter 5′-O-DMT es estable en medio básico, así que una cadena puede dejarse con el DMT puesto ('DMT-on') para facilitar la purificación y destritilarse después con ácido diluido. La síntesis de ARN protege además el 2′-OH, normalmente como éter terc-butildimetilsililo (TBS). Este resiste el tratamiento con amoniaco y se elimina al final con fluoruro, por ejemplo Et₃N·3HF, que no es lo bastante básico para escindir el ARN.

El 2′-OH y por qué el ADN perdura

El ARN se escinde en medio básico porque su 2′-OH está junto a cada 3′-fosfodiéster. El hidróxido elimina el protón del 2′-OH, y el 2′-alcóxido ataca el fósforo en línea con el 5′-oxígeno del siguiente nucleótido, que se marcha como grupo saliente. El producto es un fosfato cíclico 2′,3′ de cinco miembros (dibujado para una ribosa sin la base). El hidróxido abre después ese anillo en cualquiera de los dos enlaces P–O, de modo que la hidrólisis alcalina da una mezcla de 2′- y 3′-monofosfatos. El ataque intramolecular a través de un anillo de cinco miembros es mucho más rápido que el ataque del hidróxido externo, que además se ve repelido por la carga negativa del fosfodiéster. El ADN no tiene 2′-OH, así que sus fosfodiésteres solo se hidrolizan muy lentamente, y el ARN con 2′-O-metilo, cuyo 2′-oxígeno no tiene protón que perder, resiste el medio alcalino por la misma razón. Esto es también lo que explica que el grupo 2′-O-TBS deba permanecer hasta que terminen los pasos de desprotección en medio básico.

Lo que conviene recordar

La química de los ácidos nucleicos es química de fosfatos y de enlaces glucosídicos, controlada por unos pocos grupos funcionales. El 2′-OH hace que el ARN se autoscinda en medio básico, y su ausencia hace que el ADN sea duradero. La síntesis con fosforamiditos construye cadenas 3′→5′ activando el P(III) con un ácido débil, tapando los acoplamientos fallidos y oxidando luego el P(III) a P(V) antes del siguiente paso ácido; los grupos protectores se eligen de modo que un solo tratamiento con amoniaco elimine las amidas, los grupos cianoetilo y la unión al soporte, mientras que el DMT y el 2′-O-TBS se eliminan en sus propias condiciones. Lleva la cuenta de las cargas: una por fosfodiéster, prácticamente ninguna sobre las bases a pH 7, y cuenta las moléculas con A = εcl.

Problemas de práctica (40)

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Dibuja el mecanismo 12

Síntesis con fosforamidita

  • El 5′-OH se acopla con la fosforamidita activadaDibuja el ataque del 5′-OH libre de la cadena sobre el fosfito de tetrazolilo y la transferencia de protón que da el fosfito triéster y regenera el tetrazol.

Phosphoramidite synthesis

  • Water destroys the activated amidite as an H-phosphonateDraw the hydrolysis of an activated phosphoramidite by water and the tautomerization of the resulting dialkyl phosphite into an unreactive H-phosphonate diester.
  • Tetrazole activates a nucleoside phosphoramiditeDraw how 1H-tetrazole protonates the diisopropylamino nitrogen of a phosphoramidite and how tetrazolide then displaces diisopropylamine to give the reactive tetrazolyl phosphite.
  • Acetic anhydride and N-methylimidazole cap an unreacted 5′-OHDraw how N-methylimidazole turns acetic anhydride into an N-acetylimidazolium ion and how that ion acetylates a 5′-OH that failed to couple.
  • Dichloroacetic acid removes the 5′-O-DMT groupDraw the acid-catalysed ionization that releases the 5′-OH and the 4,4′-dimethoxytrityl cation, and explain why the cation forms so easily.
  • Iodine and water oxidize the phosphite triester to a phosphotriesterDraw the oxidation of a P(III) phosphite triester by iodine and water, with pyridine as the base, to the P(V) phosphotriester.

Protection and deprotection

  • Ammonia removes the 2-cyanoethyl group by β-eliminationDraw the β-elimination in which ammonia removes the acidic hydrogen next to the nitrile, releasing acrylonitrile and the negatively charged phosphodiester.
  • Making a phosphoramidite from the nucleoside 3′-OHDraw how the 3′-OH of a protected nucleoside displaces chloride from 2-cyanoethyl N,N-diisopropylchlorophosphoramidite, and explain why the diisopropylamino group stays on phosphorus.
  • Ammonia releases the chain from a succinyl-linked supportDraw the aminolysis of the 3′-O-succinyl ester that releases the oligonucleotide with a free 3′-OH and leaves a succinamide on the support.
  • Fluoride removes the 2′-O-TBS groupDraw how fluoride attacks silicon to release the 2′-OH of RNA from its tert-butyldimethylsilyl ether, with HF from the reagent as the proton source.

RNA versus DNA

  • Hydroxide opens the 2′,3′-cyclic phosphateDraw the attack of hydroxide on a 2′,3′-cyclic phosphate that opens the ring to a nucleoside 2′-phosphate, and explain why alkaline hydrolysis gives both 2′- and 3′-phosphates.
  • Hydroxide cleaves RNA through its 2′-OHDraw the hydroxide-catalysed transesterification in which the 2′-alkoxide of RNA attacks the adjacent phosphorus, expels the 5′-oxygen of the next nucleotide and forms a 2′,3′-cyclic phosphate.

Predice el producto 4

Protección y desprotección

  • ¿Qué sobrevive al paso con amoníaco?Predice qué grupos protectores de una síntesis de ARN con DMT se conservan tras la desprotección con amoníaco y cuáles se eliminan.

Pairing, ionization and UV

  • Guanine's Watson–Crick partnerPredict guanine's Watson–Crick partner from the donor and acceptor pattern of its pairing edge.

RNA versus DNA

  • RNA and DNA in alkaliPredict the different fates of RNA and DNA in dilute aqueous alkali from the presence or absence of the 2′-OH.

ARN frente a ADN

  • ¿Qué enlace sobrevive al álcali?Predice qué fosfodiéster de un ARN parcialmente 2′-O-metilado resiste la escisión alcalina.

Clasificar 6

Estructura de nucleósidos

  • Plegamiento del azúcar en un dúplex de ARNIdentifica el plegamiento de la furanosa que adopta la ribosa en un dúplex de ARN de forma A y compáralo con el ADN de forma B.
  • Elige el β-anómero naturalReconoce la configuración anomérica β-D de un 2′-desoxinucleósido natural a partir de las posiciones relativas de la base y de la cadena lateral de C4′.

Pairing, ionization and UV

  • The tautomer that pairs guanine with thymineIdentify the rare guanine tautomer whose hydrogen-bonding edge complements thymine.

Nucleoside structure

  • Find 2′-deoxyadenosineRecognise 2′-deoxyadenosine among ribo-, 3′-deoxy- and guanine nucleosides from its sugar oxygenation and base.
  • Name the nucleotideName a ribonucleotide from its base, its sugar and the position of its phosphate.

Estructura de los nucleósidos

  • ¿Qué nucleótido pertenece al ARN?Clasifica los 5′-monofosfatos de nucleósido como bloques de construcción del ARN o del ADN según su azúcar y su base.

Comparar 3

Pairing, ionization and UV

  • Rank the nucleosides as basesOrder the most basic ring nitrogens of three nucleosides by basicity using their conjugate-acid pKa values.
  • Rank the acidic protons of nucleic acidsOrder the acidic O–H and N–H groups found in nucleotides by acidity from their pKa values and relate them to charge at pH 7.

Apareamiento, ionización y UV

  • Ordena los dúplex por temperatura de fusiónOrdena dúplex de ADN de igual longitud por temperatura de fusión según su contenido de G·C.

Calcular 7

Apareamiento, ionización y UV

  • Concentración de oligonucleótidos a partir de A₂₆₀Calcula la concentración de una disolución madre de oligonucleótido a partir de la absorbancia de una muestra diluida con la ley de Beer–Lambert.
  • Contenido de guanina según las reglas de ChargaffUsa las reglas de apareamiento de bases de Chargaff para calcular el porcentaje de guanina de un ADN bicatenario.
  • ¿Cuánta citidina está protonada a pH 5?Calcula la fracción de citidina protonada en N3 en un tampón ligeramente ácido a partir de su pKa.
  • Cuenta los enlaces de hidrógeno entre pares de basesCuenta los enlaces de hidrógeno de Watson–Crick en un dúplex corto de ADN a partir de su contenido de G·C y A·T.

Phosphoramidite synthesis

  • Full-length yield of a 25-merCalculate the full-length fraction of an oligonucleotide from its stepwise coupling efficiency and the number of couplings.

Pairing, ionization and UV

  • Hyperchromicity on melting a duplexCalculate the percentage hyperchromicity when a DNA duplex melts from its A₂₆₀ before and after melting.
  • Net charge of a DNA 20-merCalculate the net charge of a linear oligonucleotide at pH 7 from its number of phosphodiester links.

Encuentra el error 2

Phosphoramidite synthesis

  • A synthesizer skips the iodine stepDiagnose why omitting the iodine oxidation in each cycle ruins an oligonucleotide synthesis.

ARN frente a ADN

  • Desililación demasiado prontoDiagnostica por qué eliminar los grupos 2′-O-TBS antes del paso de desprotección básica destruye un ARN sintético.

Interpreta la evidencia 2

Estructura de nucleósidos

  • Lee un dinucleótido 5′→3′Asigna la secuencia 5′→3′ de un dinucleótido a partir de cuáles oxígenos del azúcar portan el fosfodiéster.

Síntesis con fosforamidita

  • Rendimiento de acoplamiento promedio a partir del ensayo de tritiloCalcula el rendimiento de acoplamiento escalonado promedio de una síntesis de oligonucleótidos a partir de las absorbancias del catión DMT.

Planea una síntesis 2

Protection and deprotection

  • Protect the amino group of dAChoose a protecting group for the exocyclic amine of 2′-deoxyadenosine that survives every synthesis cycle and is removed by the final ammonia treatment.

Síntesis con fosforamidita

  • Ordena un ciclo de síntesisOrdena los cuatro pasos de un ciclo de síntesis con fosforamidita, partiendo de una cadena 5′-O-DMT sobre el soporte.

Explica por qué 2

Síntesis por fosforamiditas

  • ¿Por qué usar ETT con los amiditas de ARN?Explica por qué un activador de tetrazol más ácido acelera el acoplamiento de fosforamiditas de ribonucleósidos 2′-O-TBS impedidos estéricamente.

RNA versus DNA

  • Why DNA phosphodiesters resist hydrolysisExplain the resistance of the DNA phosphodiester backbone to hydrolysis in terms of its charge and the lack of an internal nucleophile.

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