Arrow Lab

Química biológica · Peptides and nucleic acids

Síntesis y ligación de péptidos

Una lección resuelta gratis y 40 problemas de práctica en los que dibujas tú mismo cada flecha curva.

¿Atascado con síntesis y ligación de péptidos? Escanea el problema.

Toma una foto de la reacción de tu tarea o de tu libro y dibuja su mecanismo con cada flecha revisada. 1 escaneo gratis ya, sin registrarte; 1 más con una cuenta gratuita.

Escanea tu tarea gratis

Lo que aprenderás

  • Draw how carbodiimides, additives and mixed anhydrides turn a carboxylic acid into an acylating agent, and predict the N-acylurea and anhydride side paths.
  • Draw Fmoc removal by piperidine (E1cB) and acidolysis of Boc, tert-butyl, trityl and 4-alkoxybenzyl groups, and choose scavengers for the carbocations they release.
  • Plan and troubleshoot the solid-phase cycle: direction of synthesis, coupling tests, loading and yield calculations, cleavage cocktails and diketopiperazine loss.
  • Explain racemization through 5(4H)-oxazolones and aspartimide formation, and predict the by-products and mass shifts they cause.
  • Draw native chemical ligation (transthioesterification, then S→N acyl shift) and explain its selectivity for an N-terminal cysteine.

Lección gratis

El texto de la lección resuelta. En Arrow Lab, cada paso incluye sus estructuras y sus flechas dibujadas.

Leer la lección gratis (7 partes)

Activa el grupo carboxilo

Mezclar un ácido carboxílico con una amina solo da una sal de carboxilato de amonio: la transferencia de protón es mucho más rápida que cualquier ataque al carbonilo, y un carboxilato es un electrófilo pobre. Por eso la síntesis de péptidos primero convierte el ácido en un agente acilante. Un carbodiimida como la DIC (N,N′-diisopropilcarbodiimida) es protonado por el ácido, y el carboxilato se adiciona a su carbono central para dar una O-acilisourea, dibujada aquí para la Boc-glicina. Su grupo saliente pasa a ser una urea, de modo que ahora una amina ataca con facilidad el carbono acílico. La DIC se prefiere sobre resina porque la diisopropilurea permanece disuelta en DMF y se elimina con los lavados; la diciclohexilurea de la DCC precipita. La O-acilisourea tiene dos rutas laterales: una segunda molécula de ácido puede atacarla para dar el anhídrido simétrico, y su propio nitrógeno de imina puede atacar el carbono acílico (un desplazamiento acilo O→N) para dar una N-acilurea no reactiva, un callejón sin salida que empeora en disolventes polares como la DMF. La N-acilurea es un isómero de la O-acilisourea, con la masa del ácido más la del carbodiimida, pero nunca acila a la amina, así que una preactivación prolongada con carbodiimida y sin aditivo desperdicia el aminoácido. Un anhídrido carbónico mixto, formado a partir del carboxilato y cloroformiato de isobutilo con N-metilmorfolina, es una alternativa más antigua: la amina ataca el carbonilo del aminoácido y se liberan CO₂ e isobutanol.

Aditivos y ésteres activos

Aditivos como el HOBt (1-hidroxibenzotriazol, pKa ≈ 4.6), el HOAt (pKa ≈ 3.3) y el Oxyma (ciano(hidroxiimino)acetato de etilo, pKa ≈ 4.6) interceptan la O-acilisourea antes de que pueda reordenarse o formar una oxazolona. La convierten en un éster activo como el éster de OBt que se muestra. Un éster activo es menos reactivo que la O-acilisourea, pero aún acila aminas con rapidez y racemiza mucho menos. El grupo saliente mejora a medida que baja el pKa de su ácido conjugado: 4-nitrofenol (≈ 7.2) < N-hidroxisuccinimida (≈ 6.0) < HOBt < HOAt. Los ésteres de pentafluorofenilo (pKa del pentafluorofenol ≈ 5.5) son ésteres activos aislables que reaccionan unas cien veces más rápido que los ésteres de 4-nitrofenilo, mientras que los ésteres de fenilo (fenol ≈ 10.0) y de metilo (metanol ≈ 15.5) son demasiado lentos para servir como agentes de acoplamiento. El HOAt es aún mejor de lo que sugiere su pKa, porque su nitrógeno piridínico está junto al grupo N–O y ayuda a la amina entrante mediante puentes de hidrógeno. Los reactivos de tipo uronio, como el HBTU y el HATU, entregan los mismos ésteres en un solo paso: el carboxilato, liberado por la DIPEA, ataca el carbono central del reactivo, y el éster de OBt o de OAt se forma junto con tetrametilurea. En realidad el HATU existe como un N-óxido de guanidinio, pero reacciona igual. El ácido carboxílico siempre debe activarse antes de encontrarse con la amina de la resina. Una amina libre ataca al propio HATU en exceso y queda bloqueada como grupo tetrametilguanidinio, que ya nunca puede acilarse.

Grupos protectores: Fmoc lábil a base, tBu, Boc y Trt lábiles a ácido

La química Fmoc/tBu se apoya en grupos protectores ortogonales. El grupo Nα-Fmoc (mostrado sobre la glicina) se elimina con piperidina al 20% en DMF, y los grupos de cadena lateral y el enlace a la resina se eliminan juntos al final con TFA al 95% aproximadamente. El Fmoc cae con base porque el C9–H del fluoreno es ácido (pKa ≈ 23 en DMSO): su base conjugada es un anión fluorenilo aromático. La piperidina elimina ese protón, el anión expulsa el carbamato (una eliminación E1cB), el ácido carbámico pierde CO₂ para liberar la amina, y una segunda piperidina se adiciona al subproducto dibenzofulveno. El aducto dibenzofulveno–piperidina absorbe a 301 nm (ε ≈ 7800 L mol⁻¹ cm⁻¹), así que medirlo da la cantidad de Fmoc liberado. Los grupos lábiles a ácido se van como carbocationes, y cuanto más estable es el catión, más suave es el ácido necesario. Los grupos Cbz y bencilo sobreviven a la TFA pura y necesitan HF o hidrogenólisis. El Boc, los éteres tBu y los ésteres tBu dan el catión tert-butilo en TFA al 25–95%. Los cationes tritilo son aún más estables: el grupo 4-metiltritilo (Mtt) sobre una amina de lisina se elimina con TFA al 1%, y el 4-metoxitritilo (Mmt) se elimina con ácido todavía más débil. El tritilo sobre el tiol de una cisteína se escinde con el cóctel final de TFA, pero se vuelve a formar a menos que se destruya el catión. Los cationes liberados alquilan Trp, Met, Cys y Tyr si los captadores no los atrapan primero: el agua captura los cationes tert-butilo, el triisopropilsilano (TIS) transfiere un hidruro al catión tritilo de forma irreversible, y el 1,2-etanoditiol protege a Cys y Met. Los grupos basados en alilo añaden una tercera dimensión independiente: el Alloc sobre una amina de lisina y los ésteres alílicos sobre Asp o Glu sobreviven tanto a la piperidina como a la TFA, y el Pd(PPh₃)₄ con fenilsilano como captador de alilo los elimina en condiciones neutras, de modo que se puede modificar una cadena lateral o cerrar una lactama de cadena lateral sobre la resina.

El ciclo en fase sólida

Las cadenas se construyen desde el extremo C hacia el extremo N. Cada residuo nuevo llega como un aminoácido protegido en Nα con un uretano (Fmoc o Boc) cuyo carboxilo está activado, y la protección con uretano mantiene esa activación libre de racemización. Un ciclo consiste en: eliminar el Fmoc, lavar, acoplar con un exceso (normalmente 3–5 equiv) de aminoácido activado, lavar y luego hacer la prueba. En la prueba de Kaiser (ninhidrina), las perlas de color azul intenso indican que quedan aminas primarias libres, así que el acoplamiento está incompleto; vuelve a acoplar o bloquea con anhídrido acético. La prolina N-terminal solo da un color rojo parduzco. Los errores se multiplican: si cada acoplamiento tiene un rendimiento y, la fracción de cadenas de longitud completa tras n acoplamientos es yⁿ, así que 29 acoplamientos al 99.0% dan 0.99²⁹ ≈ 0.747. La carga de la resina se obtiene de la prueba de Fmoc: moles liberados = A × V ÷ (ε × longitud de paso). También puede estimarse a partir del aumento de masa: sobre resina de cloruro de 2-clorotritilo, cada aminoácido unido suma su propia masa molar menos la del HCl liberado, y la carga se expresa por gramo de resina cargada. Sobre resina Wang, el péptido es un éster de un alcohol 4-alcoxibencílico, representado aquí por un éster 4-metoxibencílico. La TFA lo escinde porque el oxígeno en para estabiliza el catión bencílico. En la etapa de dipéptido, la amina recién liberada puede atacar el éster C-terminal y liberar una dicetopiperazina cíclica de la resina. Esto ocurre sobre todo con Pro o Gly en las dos primeras posiciones. La resina voluminosa de 2-clorotritilo, o añadir los dos primeros residuos como una sola unidad de dipéptido, lo suprimen.

Racemización y formación de aspartimida

Cuando se activa el carboxilo de un aminoácido o péptido N-acilo, el oxígeno de la amida vecina puede atacarlo y cerrar una 5(4H)-oxazolona, mostrada aquí para la acetil-alanina. La pérdida del C4–H da un oxazol-5-olato aromático, por lo que incluso una amina terciaria lo elimina. La reprotonación ocurre por cualquiera de las dos caras, así que se pierde el estereocentro, y luego una amina abre la oxazolona racémica para dar una mezcla de péptidos epímeros. Los grupos protectores de carbamato (uretano) hacen que las oxazolonas se formen despacio, y las 2-alcoxi-oxazolonas que sí se forman se enolizan menos. Por eso los acoplamientos por etapas de aminoácidos Fmoc conservan su configuración, mientras que los acoplamientos de segmentos peptídicos están en riesgo a menos que el residuo activado sea Gly o Pro. La formación de aspartimida es la principal reacción secundaria impulsada por base. La piperidina desprotona el N–H del esqueleto del residuo siguiente a Asp, y ese nitrógeno ataca el éster de la cadena lateral para cerrar una succinimida. Asp-Gly es la peor secuencia. La aspartimida pesa 18 Da menos que el péptido objetivo, epimeriza con facilidad y se reabre por cualquiera de los dos carbonilos. El agua da una mezcla de péptidos α- y β-aspartil (isoaspartil) de masa idéntica, y la piperidina da α- y β-piperididas (+67 Da).

Ligación química nativa

Dos péptidos sin proteger pueden unirse en agua a pH ≈ 7 (con guanidina·HCl 6 M, tampón fosfato y TCEP para mantener los tioles reducidos) cuando uno termina en un tioéster C-terminal y el otro empieza por cisteína. El tiolato de la cisteína ataca el tioéster (transtioesterificación). Este intercambio es reversible y cualquier cisteína puede participar. Solo una cisteína N-terminal tiene su α-amina colocada para atacar el nuevo tioéster a través de un anillo de cinco miembros, y este desplazamiento acilo S→N da de forma irreversible un enlace amida nativo en la unión. Con un pKa del tiol ≈ 8.3, solo 1/(1 + 10^(8.3 − 7.0)) ≈ 4.8% de la cisteína está como tiolato a pH 7.0, pero eso basta. El tiol arílico MPAA (pKa ≈ 6.6) primero convierte los tioésteres de alquilo lentos en tioésteres arílicos más reactivos. Las ε-aminas de lisina (pKa ≈ 10.5) están casi totalmente protonadas y no tienen entrega intramolecular, así que no se acilan. Para colocar alanina en la unión, liga en la cisteína y luego desulfura Cys a Ala, ya sea por un método radicalario (TCEP, el iniciador VA-044 y un tiol) o con níquel Raney. Cualquier otra cisteína debe protegerse, por ejemplo como Cys(Acm).

Lo que conviene recordar

Cada enlace peptídico es una sustitución acílica sobre un carboxilo activado. Elige la activación (carbodiimida con HOBt, HOAt u Oxyma, o una sal de uronio) que sea rápida pero evite la formación de oxazolona. Combina un grupo Nα lábil a base con grupos de cadena lateral lábiles a ácido, y captura todo carbocatión que se libere en la escisión. Vigila las reacciones secundarias predecibles: N-acilurea, guanidinilación, dicetopiperazina y aspartimida. Para cadenas largas, une segmentos sin proteger mediante ligación química nativa a través de una cisteína N-terminal.

Problemas de práctica (40)

Practicar es gratis con una cuenta.

Dibuja el mecanismo 18

Racemización, reacciones secundarias y ligación

  • La piperidina convierte Asp(OtBu)-Gly en una aspartimidaDibuja cómo el nitrógeno del esqueleto del residuo siguiente al aspartato ataca el éster terc-butílico de la cadena lateral bajo tratamiento con piperidina, cerrando el anillo de aspartimida de cinco miembros.
  • La piperidina abre una aspartimida Asp-Gly para dar la β-piperididaDibuja cómo la piperidina abre una aspartimida en el carbonilo de la cadena lateral para dar el subproducto piperidida con el esqueleto α-peptídico normal.
  • Ligación química nativa, parte 2: el desplazamiento acílico S→N forma la amida nativaDibuja el desplazamiento acílico intramolecular S→N a través de un intermediario tetraédrico cíclico de cinco miembros que convierte el tioéster de cisteína en el enlace peptídico nativo Ac-Ala-Cys-Gly-NH₂.
  • Ligación química nativa, parte 1: el tiolato de cisteína captura el tioésterDibuja la transtioesterificación en la que un tiolato de cisteína N-terminal intercambia con un tioéster peptídico para dar el intermediario S-acil cisteína.
  • El éster metílico de glicina abre la 2,4-dimetil-5(4H)-oxazolonaDibuja cómo una amina abre una 5(4H)-oxazolona en el carbonilo C5 para dar el dipéptido, y explica por qué cualquier racemización de la oxazolona se traslada al péptido.
  • La Ac-Ala activada con DIC se cierra a una 5(4H)-oxazolonaDibuja cómo el oxígeno amídico de una N-acetilalanina activada ataca su propio carbonilo activado para formar la 2,4-dimetil-5(4H)-oxazolona.
  • La trietilamina racemiza la (4S)-2,4-dimetil-5(4H)-oxazolonaDibuja cómo una amina terciaria elimina el C4–H de una oxazolona para formar un enolato aromático, y cómo la reprotonación por la cara opuesta invierte el estereocentro.

Grupos protectores y desprotección

  • El TFA elimina el tritilo de Ac-Cys(Trt)-NH₂ y el triisopropilsilano destruye el catión tritiloDibuja la escisión ácida de una cisteína S-tritilo y la transferencia de hidruro desde el triisopropilsilano que convierte el catión tritilo en trifenilmetano.
  • La piperidina atrapa el dibenzofulveno como 1-(9H-fluoren-9-ilmetil)piperidinaDibuja la adición conjugada de piperidina al dibenzofulveno y las transferencias de protón que dan el aducto estable fulveno–piperidina.
  • Fmoc-Cl protege la L-alanina en condiciones de Schotten–BaumannDibuja cómo la amina del alaninato ataca el cloroformiato de 9-fluorenilmetilo, cómo se va el cloruro y cómo el carbonato elimina el último protón para dar el alaninato de Fmoc.
  • La piperidina elimina el grupo Fmoc de Fmoc-Gly-OMe por E1cBDibuja la eliminación E1cB de un grupo Fmoc por la piperidina: desprotonación en C9, pérdida del carbamato para dar dibenzofulveno, y descarboxilación que libera la amina.
  • El TFA escinde el éter terc-butílico de Ac-Ser(tBu)-NH₂, y el agua captura el catiónDibuja la escisión catalizada por ácido de un éter terc-butílico de serina a través del catión terc-butilo, y su captura por el agua en el cóctel de escisión.

Activación del grupo carboxilo

  • Una segunda Boc-alanina convierte la O-acilisourea en el anhídrido simétricoDibuja cómo una segunda molécula de Boc-alanina ataca la O-acilisourea del DIC para dar anhídrido de Boc-alanina y N,N′-diisopropilurea.
  • El HOBt convierte la O-acilisourea de Boc-Ala en el éster activo OBtDibuja cómo el 1-hidroxibenzotriazol intercepta la O-acilisourea de la Boc-alanina para dar el éster activo OBt y N,N′-diisopropilurea.
  • Acoplamiento por anhídrido mixto de Boc-Ala-OH y H-Gly-OMe con cloroformiato de isobutiloDibuja cómo el cloroformiato de isobutilo y la N-metilmorfolina activan la Boc-alanina como anhídrido carbónico mixto, y cómo el éster metílico de glicina forma después el enlace peptídico con liberación de CO₂ e isobutanol.
  • La O-acilisourea de Boc-Ala-OH y DIC se reordena a una N-acilureaDibuja el desplazamiento acilo intramolecular O→N que convierte la O-acilisourea de la Boc-alanina en la N-acilurea no reactiva.

El ciclo en fase sólida

  • H-Ala-Pro-OMe cicla a la dicetopiperazina ciclo(Ala-Pro)Dibuja cómo la amina N-terminal libre de un dipéptido unido a la resina ataca su propio éster C-terminal, liberando el dipéptido cíclico (2,5-dicetopiperazina) del soporte.

The solid-phase cycle

  • TFA releases Ac-Gly-OH from a 4-methoxybenzyl (Wang-type) esterDraw the acid cleavage of a 4-alkoxybenzyl ester through the resonance-stabilised benzylic cation, as happens when a peptide is cleaved from Wang resin.

Predice el producto 3

Racemización, reacciones secundarias y ligación

  • Encuentra el péptido β-aspartílicoPredice la conectividad del péptido β-aspartílico (isoaspartílico) que se forma cuando se hidroliza una aspartimida.

Activating the carboxyl group

  • The first activated intermediate with DICIdentify the O-acylisourea formed when a protected amino acid reacts with a carbodiimide.

Protecting groups and deprotection

  • Which survives piperidine?Predict which fluorenylmethyl- or tert-butyl-protected glycine derivative survives Fmoc-removal conditions.

Clasificar 1

  • Elimina solo el grupo NαClasifica los reactivos de desprotección según cuáles grupos protectores Fmoc/tBu eliminan.

Comparar 3

Grupos protectores y desprotección

  • Ordena los grupos protectores de Lys según su labilidad ácidaOrdena los grupos protectores de amina según su labilidad ácida y relaciona el orden con la estabilidad del carbocatión que se libera.

Activación del grupo carboxilo

  • Ordena los ésteres de Boc-glicina según su velocidad de aminólisisOrdena los ésteres de Boc-glicina según su velocidad de aminólisis a partir del pKa del alcohol o fenol que libera cada uno.

Activating the carboxyl group

  • Rank active-ester leaving groupsRank active-ester leaving groups from the pKa of their conjugate acids.

Calcular 4

El ciclo en fase sólida

  • Carga de la resina 2-clorotrityl a partir del aumento de masaCalcula la carga de un aminoácido sobre resina de cloruro de 2-clorotrityl a partir del aumento de masa, teniendo en cuenta el HCl perdido y la masa de la resina cargada.
  • Carga de la resina a partir del test de FmocCalcula la carga de la resina en mmol/g a partir de la absorbancia del aducto dibenzofulveno–piperidina.

Racemization, side reactions and ligation

  • Mass of a piperidide by-productCalculate the mass shift of an aspartimide-derived piperidide relative to the target peptide.

The solid-phase cycle

  • How many chains are full length?Calculate the fraction of full-length chains from the per-coupling yield and the number of couplings.

Encuentra el error 2

Activación del grupo carboxilo

  • ¿Por qué falló el acoplamiento de la valina?Diagnostica un acoplamiento con carbodiimida que falló a partir de la masa y la inercia de la especie que se acumula durante una preactivación sin aditivos.
  • Una cadena bloqueada tras un acoplamiento con HATUDiagnostica la guanidinilación del extremo N causada por exponer una amina libre al HATU antes de activar el ácido.

Interpreta la evidencia 1

  • Esferas azules después del acoplamientoInterpreta un test de Kaiser positivo después de un paso de acoplamiento y elige la siguiente acción.

Trabaja hacia atrás 1

  • Which acid gave this oxazolone?Work backward from a 5(4H)-oxazolone to the N-acyl amino acid that formed it.

Planea una síntesis 4

The solid-phase cycle

  • Choose the cleavage cocktailChoose a TFA cleavage cocktail whose scavengers protect Trp, Met and Cys from carbocation side reactions.

Activación del grupo carboxilo

  • Elige los reactivos de acoplamiento para un paso rutinario de SPPSElige una carbodiimida y un aditivo para acoplamientos Fmoc rutinarios sobre resina, según la solubilidad de los subproductos y el control de las reacciones secundarias.

El ciclo en fase sólida

  • Evita la pérdida por dicetopiperazinaPlantea un cambio que evite la pérdida por dicetopiperazina en la etapa de dipéptido.

Protecting groups and deprotection

  • Protecting groups for an on-resin side-chain lactamPlan a third orthogonal protecting-group pair that lets a Lys–Glu side-chain lactam be closed on the resin during Fmoc/tBu synthesis.

Explica por qué 3

El ciclo en fase sólida

  • ¿Por qué se construye desde el extremo C?Explica por qué la síntesis química de péptidos avanza desde el extremo C hacia el extremo N.

Racemización, reacciones secundarias y ligación

  • Por qué los segmentos se racemizan pero los aminoácidos Fmoc noExplica por qué los aminoácidos protegidos como uretano se acoplan sin racemización mientras que los ácidos peptídicos N-acilo se racemizan.

Activación del grupo carboxilo

  • Por qué hay que activar el ácidoExplica por qué un ácido carboxílico y una amina forman una sal en lugar de una amida a temperatura ambiente.

¿Atascado con síntesis y ligación de péptidos? Escanea el problema.

Toma una foto de la reacción de tu tarea o de tu libro y dibuja su mecanismo con cada flecha revisada. 1 escaneo gratis ya, sin registrarte; 1 más con una cuenta gratuita.

Escanea tu tarea gratis

Antes de este tema